Screen Quest cAMP檢測(cè)試劑盒*比色ELISA法* 腺苷3'，5'環(huán)一磷酸（cAMP）是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使。檢測(cè)cAMP的水平是篩選GPCR激動(dòng)劑和拮抗劑的方法之一。 Screen Quest 比色ELISA cAMP分析試劑盒基于HRP標(biāo)記的cAMP與未標(biāo)記的cAMP之間的競(jìng)爭(zhēng)。通過未標(biāo)記的游離cAMP將HRP-cAMP從HRP-cAMP /抗cAMP抗體復(fù)合物中置換出來(lái)。在不存在cAMP的情況下，HRP-cAMP偶聯(lián)物僅與抗cAMP抗體結(jié)合。然而，測(cè)試樣品中未標(biāo)記的游離cAMP與HRP-cAMP抗體偶聯(lián)物競(jìng)爭(zhēng)抗cAMP抗體，因此抑制了HRP-cAMP與抗cAMP抗體的結(jié)合。我們的Screen Quest 比色ELISA cAMP分析試劑盒提供了一種靈敏的方法，用于在生化或基于細(xì)胞的分析系統(tǒng)中檢測(cè)腺苷酸環(huán)化酶的活性。與其他ELISA cAMP分析試劑盒相比，我們的試劑盒省去了繁瑣的乙?；襟E。該試劑盒使用Amplite Green作為比色底物來(lái)定量HRP活性。該測(cè)定可以使用96孔或384孔微孔板進(jìn)行。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供的Screen Quest cAMP檢測(cè)試劑盒*比色ELISA法*。
樣品實(shí)驗(yàn)方案
簡(jiǎn)要概述
準(zhǔn)備樣品
將75 µL /孔的cAMP標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品添加到抗cAMP的96孔板中
在室溫下孵育5-10分鐘
加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶聯(lián)物
在室溫下孵育3小時(shí)
用200 µL /孔的洗滌緩沖液洗滌4次
添加100 µL /孔的Amplite Green
在室溫下孵育1至3個(gè)小時(shí)
檢測(cè)405、650或740 nm處的吸光度增加
溶液配制
儲(chǔ)備溶液配制
1. cAMP儲(chǔ)備溶液（100 µM）：將1 mL測(cè)定緩沖液（組分B）添加到cAMP標(biāo)準(zhǔn)品（組分A）的小瓶中。
2. HRP-cAMP共軛原液（50X）：將55 µL（#36370）或550 µL（#36371）的測(cè)定緩沖液（組分B）添加到HRP-cAMP偶聯(lián)物（組分C）的小瓶中。 注意：未使用的50X HRP-cAMP共軛原液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在-20℃下保存。
3.洗滌液（1倍）：將1 mL的10X洗滌溶液（組分D）添加到9 mL蒸餾水中。
標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
在分析緩沖液（組分B）中對(duì)cAMP標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行1：10、1：100和1：3的系列稀釋，以得到10,000、100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01和0.003 nM cAMP 稀釋溶液。 存放在冰箱或4°C下。
工作溶液配制
HRP-cAMP偶聯(lián)物工作溶液：
在使用前，用測(cè)定緩沖液（組分B）以1:50稀釋，使其具有1X HRP-cAMP偶聯(lián)物工作溶液。 存放在冰箱或4°C下。 注意：25 µL 1X HRP-cAMP偶聯(lián)物工作溶液足以用于一個(gè)測(cè)定點(diǎn)； 準(zhǔn)備適當(dāng)?shù)捏w積，僅供一次性使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。
實(shí)驗(yàn)步驟
1.準(zhǔn)備樣品
1.1根據(jù)需要處理細(xì)胞：
以下是用Forskolin處理的Hela細(xì)胞以96孔板誘導(dǎo)cAMP的示例：吸出細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，在Hanks中加入100 µL /孔100μM Forskolin和20 mM Hepes緩沖液（HHBS），在5％CO2，37°C恒溫箱，放置15分鐘。孵育后吸出細(xì)胞溶液，加入100 µL /孔的細(xì)胞裂解緩沖液（組分E），然后在室溫下另外孵育10分鐘。該細(xì)胞裂解液可以直接測(cè)定，也可以在測(cè)定緩沖液（組分B）中稀釋后測(cè)定。注意：應(yīng)單獨(dú)評(píng)估每個(gè)細(xì)胞系，以確定細(xì)胞密度。細(xì)胞可以在實(shí)驗(yàn)的前或?qū)嶒?yàn)當(dāng)天接種，具體取決于細(xì)胞類型和/或受試化合物的作用。
1.2組織樣本：
由于組織中環(huán)狀核苷酸的快速代謝，重要的是在收集后快速冷凍組織（例如，使用液氮）。稱重冷凍的組織，并添加10-20 µL / mg細(xì)胞裂解緩沖液。在冰箱均質(zhì)樣品。高速旋轉(zhuǎn)5分鐘并收集上清液。上清液可以直接測(cè)定。
1.3尿液，血漿和培養(yǎng)基樣品：
尿液和血漿可以直接在1X裂解緩沖液中以1：200至1：1000的稀釋度進(jìn)行測(cè)試。也可以在裂解緩沖液中以1:10至1：200的稀釋度測(cè)試培養(yǎng)基。注意：RPMI介質(zhì)可能包含> 350 fmol / µL cAMP。
2.cAMP測(cè)定
2.1所有測(cè)定孔均按以下順序準(zhǔn)備：A）cAMP標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)照或測(cè)試樣品； B）HRP-cAMP偶聯(lián)物。
2.2將75 µL /孔的cAMP稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液和測(cè)試樣品添加到抗cAMP Ab包被的96孔板（組分F）的每個(gè)孔中。 我們建議對(duì)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品重復(fù)測(cè)定。在室溫下孵育5至10分鐘。
2.3加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶聯(lián)物工作溶液。 將板放在搖床上，在室溫下孵育3小時(shí)。
2.4吸出板內(nèi)容物，并用200 µL /孔的1X洗滌液洗滌4次。
2.5在每個(gè)孔中加入100 µL /孔的Amplite Green（組分G），并在避光的情況下在室溫下孵育60分鐘至3小時(shí)。
2.6使用光吸收酶標(biāo)儀檢測(cè)在405 nm，650 nm或740 nm處的吸光度增加。
