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　  集約化的畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中,養(yǎng)殖廢水的治理與排放已成為一項亟待解決的環(huán)境難題。凈化養(yǎng)殖廢水,降低廢水的排放對環(huán)境造成的壓力是促進畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。而廢水中的碳、氮和磷等營養(yǎng)元素如能用于培養(yǎng)有價值的生物或轉(zhuǎn)化為可直接利用的生物質(zhì),則可實現(xiàn)污水處理過程中營養(yǎng)元素的“減排”和“資源化” 。

　　微藻在生長過程中會吸收大量氮磷,在廢水處理,尤其是氮磷的去除方面具有很大潛力。迄今已篩選出了許多可凈化水質(zhì)的藻種 ,尤以綠藻居多。同時,某些微藻在特定的培養(yǎng)條件下能選擇性的蓄積油脂、蛋白質(zhì)和色素等等,開發(fā)利用的前景廣闊 。然而,微藻培養(yǎng)的高成本阻礙了微藻生物質(zhì)、生物柴油等生產(chǎn)的工業(yè)化推廣,于是人們紛紛將目光投向工農(nóng)業(yè)廢水、生活污水等含氮磷廢棄物。目前,豬場養(yǎng)殖污水、水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水、奶牛場廢水等已被證明可運用于微藻培養(yǎng)。這種培養(yǎng)方式在凈化水質(zhì)的同時又以廢水為原料獲取“新”資源和“新”能源,可謂一舉多得。

　　柵藻(Scenedesmus sp. )是一種對環(huán)境污染耐受性較高的微藻品種,由于其生長速度快、脫氮除磷能力強,常被用于廢水的凈化。在適合的培養(yǎng)條件下還可獲得生物柴油、蛋白質(zhì)等高附加值產(chǎn)品。小球藻(Chlorella sp. )能適應于多種生長環(huán)境。已有學者利用改良的廢水或廢水原液培養(yǎng)小球藻,達到了環(huán)境治理和實現(xiàn)廢水的資源化利用雙重目的。

　　本文在實驗室條件下考察斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)和普通小球藻(Chlorella vulgaris)在不同養(yǎng)殖廢水中的生長情況及其對培養(yǎng)液中氮磷的去除效果,并檢測微藻的總脂含量,旨在尋找適宜培養(yǎng)微藻的廢水種類,以期為今后廢水的深度凈化、微藻生物柴油的生產(chǎn)提供基礎(chǔ)資料。

　　1　實驗部分

　　1. 1 實驗材料

　　1. 1. 1 廢水來源

　　養(yǎng)雞場廢水和養(yǎng)豬場沼液均取自合肥溫氏畜牧有限公司下屬養(yǎng)殖場。其中雞Ⅰ廢水(以下簡稱“雞Ⅰ”)為雞舍污水厭氧發(fā)酵處理后,進入*植物凈化池的廢水;雞Ⅱ廢水(以下簡稱“雞Ⅱ”)為經(jīng)*植物池凈化后進入第二植物凈化池的廢水;豬沼廢水(以下簡稱“豬沼”)為豬場通過清糞-沉淀池-酸化池等處理工藝流程排出的沼液經(jīng)沉淀后的上清液;池塘廢水(以下簡稱“池塘”)為本單位觀賞魚養(yǎng)殖池塘水。

　　上述廢水經(jīng)0. 45 μm 微孔濾膜過濾后,與BG-11 培養(yǎng)基一同經(jīng)高壓蒸汽滅菌后備用。為防止雞Ⅰ原液中濃度較高的氨氮和豬沼原液中濃度較高的硝氮和總磷抑制微藻的生長,根據(jù)廢水原液水質(zhì)指標以及生產(chǎn)上節(jié)約成本的原則,實驗前對上述廢水原液用無菌蒸餾水進行稀釋。調(diào)節(jié)各培養(yǎng)液pH 至7. 0 左右后,重新測定NH4+ -N、NO3- -N、TN、NO2- -N 和TP,結(jié)果見表1。

表1　廢水培養(yǎng)液的水質(zhì)指標

　　1. 1. 2 藻種來源與預培養(yǎng)

　　實驗用斜生柵藻(FACHB-14)和普通小球藻(FACHB-31)均購自淡水藻種庫。預培養(yǎng)條件為:環(huán)境溫度25 ℃ ,光強2 400 lx,光暗比12 h∶ 12 h。培養(yǎng)基為經(jīng)過滅菌的BG-11 培養(yǎng)基。

　　1. 2 實驗方法

　　1. 2. 1 藻種培養(yǎng)

　　吸取處于對數(shù)生的上述2 種藻種液分別接種于4 種廢水培養(yǎng)液和BG-11 中,使得每瓶藻液初始密度均為2. 5 × 106 ind. ·mL - 1 左右,每個處理組設3 個平行。培養(yǎng)條件同預培養(yǎng)。

　　1. 2. 2 藻細胞生物量測定

　　采用細胞干重法,取一定體積的藻液,離心濃縮后冷凍干燥24 h,稱重,用單位體積干重表示。所得藻粉用于總脂含量的測定。每個樣品平行測定2 次。

　　1. 2. 3 水質(zhì)指標測定

　　用0. 45 μm 濾膜過濾藻液,然后參照《水和廢水監(jiān)測分析方法(第4 版)》測定濾液中氮磷含量。氨氮測定采用納氏試劑分光光度法,硝氮測定采用酚二磺酸分光光度法,總氮測定采用堿性過硫酸鉀消解-紫外分光光度法,亞硝氮測定采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法,總磷測定采用鉬酸銨分光光度法。每個樣品平行測定2 次。

　　1. 2. 4 總脂含量測定

　　總脂測定采用lv仿-甲醇法,每個樣品平行測定2 次。

　　2　結(jié)果與分析

　　2. 1 微藻在廢水中的生長情況

　　小球藻和柵藻在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)23 d 后,收獲的藻液顏se情況如表2 所示。

表2　收獲的藻液顏色

　　測定各處理組單位體積的細胞干重(見圖1),結(jié)果表明,柵藻與小球藻在不同培養(yǎng)液中的生長情況差異很大。由表2 和圖1 中可以看出,柵藻實驗組中,BG-11 中收獲的斜生柵藻zui多(0. 168 5 g·L - 1 ),同時在4 種廢水培養(yǎng)液中的收獲量大小依序為:豬沼> 雞Ⅰ > 池塘> 雞Ⅱ,尤其在后2 者中,藻液顏色變淺變黃,說明這2 種環(huán)境不利于斜生柵藻的生長。馬紅芳等 在水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中培養(yǎng)柵藻LX1(Scenedesmus sp. LX1),至穩(wěn)定期后其生物量干重可達0. 38 g·L - 1 ,說明柵藻LX1 在水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中能較好生長,與本實驗結(jié)果差距較大,分析可能是由于養(yǎng)殖廢水種類(高密度/ 生態(tài)養(yǎng)殖)、預處理方法、藻種、培養(yǎng)條件等的差異造成的。

　　小球藻在5 種培養(yǎng)液中的生物量大小:豬沼> BG-11 > 雞Ⅰ > 雞Ⅱ > 池塘。與柵藻中情況類似,雞Ⅱ和池塘水同樣不適于小球藻的生長。但是,豬沼中的收獲量(0. 353 1 g · L - 1 ) 是BG-11 中收獲量(0. 189 8 g·L - 1 )的1. 86 倍。黃學平等 對小球藻、柵藻、微囊藻3 類藻在養(yǎng)豬廢水8 種不同處理階段的水樣中進行藻生長適應性綜合評價研究,結(jié)果表明,3 種藻類中小球藻生長的綜合適應能力zui強,小球藻能在養(yǎng)豬廢水中生長成為優(yōu)勢藻種?？梢?經(jīng)過一定預處理的豬沼廢水作為一種資源廢水應用于小球藻的培養(yǎng)大有前景。

　　2. 2　2 種微藻對廢水水質(zhì)的凈化效果

　　2. 2. 1 對氨氮的去除效果

　　從圖2 可以看出,柵藻對雞Ⅰ培養(yǎng)液中氨氮的去除率達86. 00% ,對豬沼培養(yǎng)液中氨氮的去除率zui低,僅為18. 86% 。由于不同培養(yǎng)液中同一水質(zhì)指標的初始值差異較大,因此,不能僅計算各種營養(yǎng)鹽濃度降低的相對量,還要考查微藻對其的實際吸收量。參照培養(yǎng)液中氨氮的起始濃度可得知,柵藻對培養(yǎng)液中氨氮的去除量大小順序是:雞Ⅰ(8. 30 mg·L - 1 )、池塘(0. 52 mg·L - 1 )、豬沼(0. 38 mg·L - 1 )、雞Ⅱ(0. 17 mg·L - 1 )。培養(yǎng)過程中柵藻顯著降低了雞Ⅰ中的氨氮含量,而對低濃度氨氮(雞Ⅱ和豬沼等) 的去除作用卻不如前者。分析造成吸收量有高低的原因可能與與溶液中硝氮的濃度有關(guān)。馬紅芳等和包苑榆等 的研究結(jié)果顯示,斜生柵藻偏好吸收NH4+ -N。后者利用15 N 穩(wěn)定同位素技術(shù)研究了斜生柵藻對氨氮和硝氮的吸收特征。結(jié)果顯示: 在14 NO3- -N 和15 NH4+ -N 同時存在的混合組中,硝氮的存在,抑制了斜生柵藻對氨氮的吸收。而且硝氮濃度越高,抑制作用越大。綜合表1 和圖2 可以看出,雞Ⅰ和池塘中硝氮的濃度小于氨氮,這兩處理組中微藻對氨氮的吸收量較多。而其他2 組中硝氮的濃度大于氨氮濃度,且硝氮濃度越大,對氨氮的吸收量也越低,抑制作用越明顯。更直接和真實的證明多種形態(tài)氮同時存在時,藻類對一種形態(tài)氮的吸收受另一種形態(tài)氮的影響。

　　各組小球藻去除氨氮的量:雞Ⅰ(5. 25 mg·L - 1 ) > 豬沼(0. 95 mg·L - 1 ) > 池塘(0. 56 mg·L - 1 ) > 雞Ⅱ(0. 20 mg·L - 1 )。對比2 種微藻對不同培養(yǎng)液中氨氮的去除率,可以發(fā)現(xiàn)柵藻對較高濃度氨氮(雞Ⅰ)的去除效果好于小球藻,而小球藻對較低濃度氨氮的去除效果優(yōu)于柵藻。ASLAN 等 在pH 7. 0,室溫(20 ± 2)℃ ,光照為4 100 lx,氮、磷濃度比2 ∶ 1 的條件下,研究了普通小球藻對廢水中氮、磷的去除效果。

　　結(jié)果表明,普通小球藻在氨態(tài)氮初始濃度為21. 2 mg·L - 1 時,對氨態(tài)氮的去除率為 。顯著高于本實驗中的初始濃度和去除率,這可能與實驗采用的養(yǎng)殖廢水中氮素的形態(tài)及含量不同有關(guān),也提示我們今后可以從溫度、光照、氮磷比等多方面對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,提高小球藻對氨氮的吸收率。

　　2. 2. 2 對硝氮的去除效果

　　由圖3 可知,在雞Ⅱ培養(yǎng)液中柵藻和小球藻對硝氮的去除率zui高。豬沼培養(yǎng)液中,2 種微藻對硝氮的去除率低于其他組,但均在60% 以上。2 種微藻對硝氮的去除效果大致相同,去除量由大到小依次為:豬沼、雞Ⅱ、雞Ⅰ、池塘,均隨著硝氮初始濃度的降低而減少。剩余量除豬沼組(柵藻4. 70 mg·L - 1 ,小球藻4. 74 mg·L - 1 )外,其余各組較少(0. 30 mg·L - 1 左右)。

　　由表1 可見,雞Ⅱ和豬沼培養(yǎng)液中硝氮的濃度大于氨氮濃度,氨氮的抑制作用較弱,2 種微藻對硝氮的吸收利用較多。尤其在豬沼中,雖然2 種微藻的去除率都不高,但是去除的量zui多(柵藻9. 86mg·L - 1 ,小球藻9. 82 mg·L - 1 )。對于雞Ⅰ和池塘培養(yǎng)液,雖然氨氮濃度大于硝氮,抑制作用強,但因其初始值很低,故而雖實際的去除量并不大但去除效率高。有研究結(jié)果顯示,硝氮較適合普通小球藻的生長。因此,在硝氮含量zui高的豬沼培養(yǎng)液中收獲的小球藻藻粉質(zhì)量也zui多。對比2 種微藻對硝氮的去除率發(fā)現(xiàn),柵藻對硝氮的吸收同化效果稍好于小球藻。

　　2. 2. 3 對總氮的去除效果

　　由圖4 可知,小球藻和柵藻對雞Ⅱ、豬沼和池塘培養(yǎng)液中總氮的去除率較高,在62. 79% ~ 84. 54% 之間,對雞Ⅰ中總氮的去除率較低(33. 73% 和42. 86% )。結(jié)合總氮初始值,實際總氮減少量:豬沼> 雞Ⅰ >雞Ⅱ > 池塘,與初始值大小排序相同。認為這種結(jié)果與溶液中無機氮的含量有關(guān)。浮游植物可以直接利用水體中的可溶性無機氮,但對有機氮一般需要降解為溶解性無機氮后方可利用。實驗開始時,豬沼、雞Ⅰ、雞Ⅱ和池塘中無機氮(氨氮、硝氮及亞硝氮等)的總量分別為19. 56、10. 38、4. 33 和2. 42 mg·L - 1 ,均超過有機氮含量,且其中又以氨氮和硝氮居多,適宜的無機氮形態(tài)和濃度有利于微藻的吸收利用,因而產(chǎn)生上述結(jié)果。

　　微藻去除氮的機理包括直接作用和間接作用2種方式。直接作用就是微藻對氮的去除實際上是微藻對各種無機氮和有機氮的同化作用的疊加效果。因此,總生物量(氨基酸、蛋白質(zhì))的增加抵消了培養(yǎng)基中部分氮素的減少。以小球藻+ 豬沼和柵藻+ 豬沼組為例,豬沼的初始總氮(32. 10 mg·L - 1 )和去除率(84. 53% 和84. 54% ) 均高于其他組,得到的藻粉質(zhì)量也多(0. 353 1 和0. 131 1 g·L - 1 );而初始總氮很低的雞Ⅱ(4. 79 mg·L - 1 ) 和池塘組(2. 71 mg·L - 1 ),既使藻體對總氮的去除率較高(62. 79% ~ 81. 15% ),收獲的小球藻和柵藻藻粉仍然很少(0. 021 8~ 0. 083 0 g·L - 1 )。同時,微藻的光合作用可以使水體的pH 值升高,導致NH3 ·H2 O 以揮發(fā)的形式去除,從而間接除氮。

　　2. 2. 4 對亞硝氮的去除效果

　　由圖5 可知,柵藻+ 雞Ⅰ組和柵藻+ 雞Ⅱ組以及小球藻+ 雞Ⅱ組中亞硝氮的去除率均在90% 以上。此外,小球藻對雞Ⅰ和池塘培養(yǎng)液中亞硝氮的去除率也在80% 以上。計算得各組亞硝氮減少總量:豬沼和池塘組> 雞Ⅰ和雞Ⅱ組。亞硝氮初始濃度較高的溶液中,2 種微藻對其吸收量多。而初始濃度較低的組,吸收利用率高。

　　養(yǎng)殖廢水成分復雜,藻種對廢水中不同形態(tài)氮的吸收除了與藻種(株)的內(nèi)在生理特性差異、培養(yǎng)的環(huán)境條件有關(guān)外,還會受到培養(yǎng)液中其他物質(zhì)成分的影響,從而導致在不同的培養(yǎng)時期培養(yǎng)液中三態(tài)氮濃度的變化趨勢不同。因此,尋找適宜的培養(yǎng)條件增強微藻對氮的凈化效果以及探索不同形態(tài)的氮之間吸收利用的相互影響等方面,尚待進一步的實驗。

　　2. 2. 5 對總磷的去除效果

　　柵藻和小球藻對廢水中磷的凈化效果很好(見圖6)。2 種微藻對雞Ⅱ、豬沼和池塘廢水中總磷的去除率均在90% 以上。對雞Ⅰ培養(yǎng)液中總磷的去除率(柵藻89. 32% 和小球藻89. 48% ) 也接近90% 。

　　實驗結(jié)束時,柵藻和小球藻使雞Ⅰ和豬沼培養(yǎng)液中的總磷分別減少了2. 18 mg·L - 1 和4. 95 mg·L - 1 ,不但去除率高,去除量也很大?？赡苁? 種培養(yǎng)液中的磷含量均在適宜微藻生長的濃度范圍內(nèi),尤其豬沼初始總磷(5. 02 mg·L - 1 )與預培養(yǎng)中微藻生長的BG-11 培養(yǎng)基磷含量相近(5. 43 mg·L - 1 ),更適于微藻生長。因此,適宜培養(yǎng)微藻的廢水,不但其所含氮、磷種類要適于微藻生長,氮、磷濃度也要在合適的范圍內(nèi)。

　　與本實驗結(jié)果相近的是,陳春云等 研究了小球藻對工廠化對蝦養(yǎng)殖廢水中磷的去除,磷酸鹽的去除率達到了85% 以上;劉林林等 調(diào)查了多種柵藻和小球藻等對豬場養(yǎng)殖污水中氮磷的去除效果,發(fā)現(xiàn)各株微藻對污水中總磷的去除率均很高,可達91. 00% 以上。高保燕等 利用奶牛場廢水培養(yǎng)富含油脂的尖狀柵藻(S. acuminatus),該藻對磷的去除效率達到99. 4% 。可見小球藻和柵藻均是進行廢水凈化除磷的優(yōu)良藻種。

　　2. 3 利用養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)的微藻細胞油脂含量

　　由圖7 可知,收獲時各藻粉樣品的油脂含量均超過30% ,甚至可達到40% 以上,說明普通小球藻和斜生柵藻是潛力的產(chǎn)油微藻。在豬沼培養(yǎng)液中,小球藻油脂含量(50. 34% ) 高于BG-11 培養(yǎng)基(48. 26% ),而其在其他廢水培養(yǎng)液中提取到的油脂含量則低于BG-11 培養(yǎng)基,說明豬沼中的成分有利于小球藻積累油脂。柵藻組中,豬沼中獲得的油脂單位含量(48. 45% )與BG-11 中(48. 43% )相近,高于其他組藻粉的油脂含量。

　　氮缺乏會導致微藻油脂的積累,在缺氮的HSM 培養(yǎng)基中微芒藻(Micractinium pusillum Y-002)的油脂含量超過HSM 含量的10 倍以上 ,隱甲藻(Crypthecodinium cohnii) 的油脂和DHA 的含量也較高。其原因可能為氮源缺乏時,含氮元素較少的貯存脂類和絕大多數(shù)膜質(zhì)仍能繼續(xù)合成,導致在細胞干質(zhì)量中的含量增加 。磷是構(gòu)成DNA、RNA、ATP 和細胞膜的必要元素。通過對磷限制條件下海洋微藻油脂含量影響的研究發(fā)現(xiàn),磷限制會導致三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、角毛藻(Chaetocerossp. )和魯茲巴夫藻(Pavlova lutheri)的油脂含量增加,但是綠色鞭毛藻、擬球藻(Nannochloris sp. )和融合微藻(Tetraselmis sp. )的油脂含量降低 。即對于不同的藻種,磷限制導致的結(jié)果不同。與BG-11 中的氮(247 mg·L - 1 )和磷(7 mg·L - 1 )含量相比,4 種廢水培養(yǎng)液中氮磷含量均較低,但zui終的油脂含量卻沒有明顯降低,說明在本實驗過程中,低氮、低磷條件下可獲得較高的油脂含量。尤其在雞Ⅱ和池塘培養(yǎng)液中,低磷濃度雖然限制了柵藻和小球藻的生長,但對微藻總脂含量的影響不顯著。

　　后人對湖泊和近海處的上千種藻種的產(chǎn)油效率進行了分析,發(fā)現(xiàn)微藻油脂含量(% ,干質(zhì)量) 普遍為20% ~ 50% 。在適宜的培養(yǎng)條件下,微藻體內(nèi)油脂含量還可顯著提高。CONVERTI 等 的研究表明,C. vulgaris 在25 和30 ℃ 下生長速率一樣,但是在25 ℃ 生長下的藻油脂的積累速率和產(chǎn)量分別是后者的2. 7 和5. 0 倍。石娟等 對小新月菱形藻(Nitzschia closterium f. minutissima)和等鞭金藻(Isochrysis galbana Parke)8701 的研究發(fā)現(xiàn),低光下2 種藻的脂肪含量多而高光下則相反。在對其他餌料微藻的研究中也得到了相似的結(jié)果 ?？梢?本實驗中各培養(yǎng)液的營養(yǎng)鹽條件和25 ℃ 、較低光強的環(huán)境條件適宜于微藻油脂的積累。但是在生產(chǎn)實際上,產(chǎn)油能源微藻的應用價值不僅僅體現(xiàn)在單位藻細胞的油脂含量,還取決于藻細胞的生物量,即微藻油脂生成總量= 藻細胞生物量× 單位藻細胞油脂含量。由此看來,豬沼培養(yǎng)液中的微藻生物量和細胞油脂含量均處于較高水平,具備生產(chǎn)能源微藻的潛力。

　　3　結(jié)論與展望

　　1)微藻在廢水中的生長。在本實驗條件下,柵藻在各廢水培養(yǎng)液中的產(chǎn)量低于BG-11 培養(yǎng)基中的產(chǎn)量。而在豬場沼液中收獲到的小球藻生物量明顯高于BG-11 以及其他培養(yǎng)基中的生物量。

　　2)微藻對廢水的凈化。2 種微藻對總磷的去除效果。氨氮和硝氮對微藻的吸收存在互相干擾。柵藻對硝氮的去除率高于小球藻。

　　3)微藻細胞的油脂產(chǎn)量。單位質(zhì)量的各組藻粉含油量均在30% 以上。豬沼培養(yǎng)液中,小球藻和柵藻的油脂含量高于其他組,加之同一培養(yǎng)條件下較高的藻粉產(chǎn)出,證明豬場沼液運用于培養(yǎng)產(chǎn)油微藻是可行的。

　　4)廢水資源培養(yǎng)能源微藻,降低了廢水處理以及微藻培養(yǎng)的成本,同時收獲了微藻生物質(zhì)或其高附加值產(chǎn)品,使廢水變廢為寶,減少了廢水排放所帶來的環(huán)境污染,有利于社會的可持續(xù)發(fā)展。今后的研究還可從以下兩個方面進行:藻粉產(chǎn)量的提高:通過添加外源氮磷,以增加易吸收營養(yǎng)鹽或調(diào)節(jié)培養(yǎng)液氮磷比的方式來達到增產(chǎn)的目的,但同時不能增加環(huán)境壓力,使余水成為新的污染源;確定微藻的收獲時間:微藻的凈化效果、產(chǎn)量和油脂含量與微藻的生長時期密切相關(guān),掌握合適的收獲時間,可節(jié)約培養(yǎng)成本,更可獲得zui大的綜合收益。