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上海酶聯(lián)生物研究所


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經(jīng)營(yíng)模式：生產(chǎn)廠家

商鋪產(chǎn)品：4010條

所在地區(qū)：上海上海市

聯(lián)系人：采購(gòu)部 （經(jīng)理）

技術(shù)文章

感受態(tài)細(xì)胞的制備

閱讀：532發(fā)布時(shí)間：2011-10-14

1.挑取適當(dāng)菌株的E.coli 單菌落接種于2ml SOB培養(yǎng)液中，37℃搖床過(guò)夜。

2.取0.5-1ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)種到50ml SOB中，18℃劇烈震蕩，直到A600達(dá)到0.6。

3.將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，4℃ 4,000rpm/min離心10min。同時(shí)在冰浴上配置TB溶液。

4.棄上清，將離心管倒置于濾紙上，使培養(yǎng)液被吸干。

5.取1ml剛配的TB溶液打散菌體沉淀，再加入15ml TB（1/3體積的起始培養(yǎng)液），冰浴10-15min，4℃ 4,000rpm/min離心10min。

6.棄上清，沉淀重懸于4ml TB（1/12.5體積的起始培養(yǎng)液），冰浴10min。

7.加入280μl DMSO，緩緩滴入并輕輕搖晃，使其充分混合均勻，冰浴10min。

8.將菌液分裝于EP管中，-80℃或液氮凍存。

9. 取兩管感受態(tài)細(xì)胞分別加入1μl無(wú)菌ddH2O（陰性對(duì)照）和1μl純質(zhì)粒（陽(yáng)性對(duì)照）進(jìn)行轉(zhuǎn)化（見(jiàn)后），以檢測(cè)感受態(tài)的質(zhì)量。陰性對(duì)照平板上應(yīng)該無(wú)菌落生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照平板上菌落數(shù)目的多少顯示感受態(tài)效率的高低。

SOB的配制：

蛋白胨 20g

酵母提取物 5g

NaCl 0.58g

KCl 0.186g

100×Mg++溶液 10ml

溶解并加水定容至1L，121℃×20min高壓蒸汽滅菌

100×Mg++溶液：

MgCl2﹒6H2O

MgSO4﹒7H2O

溶解并加水定容至100ml，121℃×20min高壓蒸汽滅菌

TB溶液的配制：

1M KCl 5ml

0.55M MnCl2 2ml

0.5M CaCl2 0.6ml

0.1M K-Pipes（pH 6.7） 2ml

ddH2O 10.4ml

Total 20ml

注：上述溶液均需高壓蒸汽滅菌處理

0.1M K-Pipes（pH=6.7）的配制：

稱取3.02g Pipes粉末溶于80ml dd H2O中，此時(shí)粉末不能*溶解，用10N KOH或KOH固體調(diào)節(jié)PH值，只有當(dāng)PH接近6.7時(shí)粉末才能*溶解，此時(shí)當(dāng)小心少量地加入KOH直至達(dá)到所需PH值。

 


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