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上海酶聯(lián)生物研究所
上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：2777發(fā)布時間：2011-10-25
【原理】
免疫沉淀反應(yīng)（Immunoprecipitation）主要用于抗原或者抗體的定性檢測。其原理是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在有電解質(zhì)存在的情況下，按適當比例所形成的可見沉淀物現(xiàn)象。據(jù)此現(xiàn)象設(shè)計的沉淀實驗主要包括絮狀沉淀試驗，環(huán)狀沉淀試驗和凝膠內(nèi)的沉淀試驗。凝膠內(nèi)的沉淀試驗依所用的實驗方法又可分為免疫擴散實驗和免疫電泳技術(shù)2類。
【材料】
1. 蛋白A 或蛋白G
2. 一抗
3. 免疫沉淀緩沖液：20 mM 磷酸鈉, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP40, 0.5% 脫氧膽酸鈉 and 0.02% *. （> NOTE: 50 mM 醋酸鈉緩沖液, pH 5.0,. 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40 and 0.02%*也可作為免疫沉淀的緩沖液，能提高蛋白G的結(jié)合功效）
4. 洗脫液：0.1 M *-HCl buffer, pH 2.5
5. SDS-PAGE 上樣緩沖液 （pH 6.8）： 2% SDS, 62.5 mM Tris 堿, 10% 甘油, 2-5% 2-巰基乙醇
【步驟】
1. 用50 µl免疫沉淀緩沖液溶解抗原，向溶液中加入1倍過量的特異性一抗。加入免疫沉淀緩沖液至樣品體積為0.2 ml。一般情況下，在此體積下2-5µg的純化抗體能夠較好地形成抗原抗體復(fù)合物。
2. 樣品4℃.孵育過夜。
3. 將適量的蛋白A或蛋白G加到抗原抗體復(fù)合物中（~ 50 µl of gel per 5 µg of antibody）。
4. 室溫下，輕柔混勻樣品，孵育2小時。
5. 用0.5ml免疫沉淀緩沖液洗蛋白A或蛋白G連接的抗原抗體復(fù)合物，離心2-3分鐘，棄上清。重復(fù)此步驟至少6次。
6. 用50 µl洗脫液孵育蛋白A或蛋白G連接的抗原抗體復(fù)合物5分鐘，將抗原抗體復(fù)合物從蛋白A或蛋白G上洗脫下來，離心，收集上清。另用50 µl洗脫液孵育膠5分鐘，離心，收上清。將兩個上清混合。
7. 立即調(diào)節(jié)蛋白樣品的pH至生理值，用一種合適的、多次離心的緩沖液調(diào)節(jié)，如1.0 M Tris, pH 7.5 （10 µl of this buffer to 100 µl of the supernatant should be sufficient）.
8. 將洗脫成分除鹽。
9. 準備好樣品待定性。
NOTE：如果用SDS-PAGE定性蛋白質(zhì)，省去步驟6-9。在完成第5步之前，用0.5ml蒸餾水洗膠。離心蛋白A或蛋白G 2-3分鐘，棄上清。用25µl SDS-PAGE上樣緩沖液在95°C孵育蛋白A或蛋白G連接的抗原抗體復(fù)合物5分鐘。樣品離心，收集上清。重復(fù)一次，匯集上清至總體積50µl。由此樣品則準備妥當。
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