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上海酶聯(lián)生物研究所
上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：580發(fā)布時間：2011-10-10
細胞內(nèi)細胞因子的檢測、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19的檢測等。
操作過程：
（1）直接法：
細胞→3％多聚甲醛固定和 滲透化→封閉→熒光素標記的抗體→ 洗滌→熒光顯微鏡觀察或流式細胞計分析
（2）間接法：
細胞→3％多聚甲醛固定和滲透化→封閉→針對蛋白的特異抗體→洗滌→熒光素標記的二抗→洗滌 → 熒光顯微鏡觀察或流式細胞計分析
凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析
TFAR19（PDCD5）是由本研究室在上首先報導(dǎo)的一個擁有自己知識產(chǎn)權(quán)的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進細胞凋亡的增強劑。利用熒光素（FITC）標記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19表達水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。同時我們發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰*（PS）外翻和細胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一。進一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義，不同細胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達和核轉(zhuǎn)位。這為研究細胞凋亡早期所發(fā)生的事件，提供了一種新的技術(shù)和指標。
1 懸浮細胞的染色：
（1）收獲正常和誘導(dǎo)凋亡的細胞（0.5~1×106），PBS洗2次，
（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，
（4）加入200ml胎牛血清，室溫反應(yīng)30min。
（5）加入 FITC標記的TFAR19單抗，4°C反應(yīng)30min
（6）熒光細胞洗液洗2次，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細胞中的定位。同時用流式細胞計定量檢測TFAR19蛋白的平均熒光強度。
2：貼壁細胞的原位染色
（1） 貼壁生長的對數(shù)期細胞鋪在24孔或6孔板中（內(nèi)有潔凈蓋玻片），讓其爬片生長，待長到50%~80%滿時，凋亡誘導(dǎo)劑處理細胞。
（2） 將不同時間點處理的細胞進行免疫熒光染色，染色步驟同上。
（3） 將染色的爬片細胞放于一張滴有少量甘油（5ul）的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡觀察TFAR19在細胞中的定位。
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