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技術文章

組織勻漿的制備

閱讀:1461發(fā)布時間:2011-12-10

        1、取組織塊(0.2~1g)zui少可到2~5mg在冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干,稱重,放入5或10ml的小燒杯內(nèi)。

        2、用移液管量取預冷的勻漿介質(pH7.4,0.01mol/L Tris-HCl,0.0001mol/L EDTA-2Na,0.01mol/L 蔗糖0.8%的氯化鈉溶液)或者用0.86%冷生理鹽水,勻漿介質或者生理鹽水的體積總量應該是組織塊重量的9倍,用移液管或移液器取總量2/3的勻漿介質或生理鹽水于燒杯中,用眼科小剪盡快剪碎組織塊(天熱時操作要在冰水浴中進行,將盛有組織的小燒杯放入冰水中)。

        3、勻漿的方式有多種:手工勻漿,機器勻漿,超聲粉碎,反復凍融。

        ①手工勻漿:將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中,再將剩余的1/3勻漿介質或冷生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊,一起倒入勻漿管中進行勻漿,左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手將搗桿垂直插入套管中,上下轉動研磨數(shù)十次(6~8分鐘),充分研碎,使組織勻漿化。

        ②機器勻漿:用組織搗碎機10000~15000r/min上下研磨制成10%組織勻漿,也可用內(nèi)切式組織勻漿機設備(勻漿時間10秒/次,間隙30秒,連續(xù)3~5次,在冰水中進行),皮膚、肌肉組織等可延長勻漿時間。

        ③超聲粉碎:用超聲粉碎機進行粉碎,可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎,也可用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀,用400安培,5秒/次,間隙10秒反復3~5次。

        ④反復凍融:培養(yǎng)或者分離的細胞可以用以上①②③的方法勻漿,也可以反復凍溶3次左右(即讓細胞加適量的低滲液或者雙蒸水放低溫冰箱中結冰,溶解,再結冰,再溶解,反復3次左右),但有部分酶活力會受影響。

        ⑤取少量組織勻漿作涂片(直接涂片、染色均可以),顯微鏡下觀察細胞是否磨破,若沒有破則可延長勻漿時間或增加凍溶次數(shù)(此步可省略)。

        4、將制備好的10%勻漿用普通離心機或低溫低速離心機2000r/min左右離心10~15分鐘,若檢測ATP酶,則只需要1000轉/分,離心5分鐘,將離心好的勻漿留上清棄下面沉淀。

        根據(jù)你的實驗需要,取適量上清液進行各種測定。


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